روش اندازه گیری کلروفیل، پرولین و محتوای آب نسبی برگ

استخراج کلروفیل برگ پرچم با استفاده از استون و اندازه گیری آن با استفاده از روش تغییر یافته آرنون (1949)انجام میگردد. به این منظور ابتدا 5/0 گرم برگ پرچم فریز شده با استفاده از نیتروژن مایع وآون چینی پودر شده به همراه 5/0 گرم سولفات منیزیم  و 10 میلی لیتراستن 80% در داخل هاون چینی خوب ساییده میشود. سپس عصاره بدست آمده به وسیله کاغذ صافی واتمن صاف شده و  در داخل لوله های آزمایش در دار ریخته شده  و سپس نمونه ها به مدت 2 دقیقه با سرعت 2500 دور در دقیقه سانتریفوژ می گردندو پس از اینکه عصاره یکنواختی بدست آمد  این عصاره ها بطور جداگانه در داخل لوله های دردار ریخته میشوند. لازم به ذکر است که تمامی عملیات مراحل استخراج و اندازه گیری در زیر نور سیز کمرنگ و دمای چهار درجه سانتی گراد انجام میشود. سپس میزان جذب نوری بدست آمده با استفاده از اسپکتروفتومتر(Varian300Scan,USA ) در طول موجهای 663 و645 نانومتر قرائت می گرددو غلظت کلروفیل aو b بر اساس روابط زیر تعیین میگردد.در روابطV زیرحجم نهایی نمونه استخراج شده وW وزن تر نمونه است.       

میلی گرم کلروفیلa  در هر گرم وزن تر:

(w*1000)/v*{( جذب در 645نانومتر (69/2 - (جذب در 663نانومتر)7/12{

میلی گرم کلروفیلb  در هر گرم وزن تر:

(w*1000)/v*{( جذب در 663نانومتر (69/4 - (جذب در 645نانومتر)9/22{

میلی گرم کلروفیلbو a  در هر گرم وزن تر:

(w*1000)/v*{( جذب در 663نانومتر (02/8 + (جذب در 645نانومتر)9/22{

وپرولین :

ابتدا 5/0 گرم از بافت گیاهی (برگ پرچم )توزین شده و سپس 5میلی گرم اسید سولفوسالیسیلیک 3درصد به آن اضافه شده و به خوبی ساییده ،محلول حاصل با استفاده از کاغذ صافی و استن صاف میگردد.از عصاره حاصل 5/1 میلی لیتر در لوله آزمایش ریخته و بر روی آن 1 میلی لیتر  اسید نین هیدرین و یک میلی لیتر اسید استیک خالص اضافه می شود. لوله های آزمایش در حمام آب گرم بمدت یک ساعت در دمای 100 درجه قرار میگیرند. بلافاصله بعد از خارج کردن از حمام آب گرم به درون ظرف آب سرد، جهت متوقف شدن واکنشها منتقل م گردد.در این مرحله 4 میلی لیتر تولوئن اضافه و بمدت 20 ثانیه بشدت بهم زده می شود. تا اینکه دو لایه مجزا از همدیگر تشکیل گردد.بخش بالایی دارای تولوئن به وسیله پیپت پواردار جدا شده ودر دمای آزمایشگاه خنک می گردد. میزان جذب بخش بالایی در طول موج 520 نانومتر با استفاده از شاهد تولوئن توسط دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت میگردد.  

 

ضمن آنکه همراه ، با این اندازه گیریها محتوای رطوبت نسبی (RWC ) :

تعیین RWC در سه مرحله رشدی پس از گلدهی انجام میپذیرد. از هر واحد آزمایشی تعداد 3 عدد برگ پرچم انتخاب و بلافاصله به آزمایشگاه انتقال می یابند و با دقت 001/0گرم توزین می گردند. سپس این برگها به مدت 24 ساعت در آب مقطر قرار داده شده و دوباره توزین میگردند(وزن اشباع). در نهایت این برگها به مدت 48 ساعت در دمای 75 درجه سانتیگراد در آون نگهداری و سپس وزن خشک آنها تعیین میگردد. درصد رطوبت نسبی برگ پرچم با استفاده از فرمول زیر محاسبه میشود :

RWC=(FW-DW/SW-DW)*100 %

 

FW= وزن تر برگ ، DW= وزن خشک برگ ، SW=وزن اشباع برگ